Rekayasa Genetika: Restriksi, Ligasi, PCR
Setelah ini kamu bisa mengenal enzim restriksi, DNA ligase, dan PCR sebagai alat dasar rekayasa genetika untuk memotong, menyambung, dan memperbanyak DNA.
Insulin untuk diabetes dulu diambil dari pankreas babi dan sapi — mahal dan sering alergi. Kini insulin dibuat bakteri yang “direkayasa” membawa gen insulin manusia. Bagaimana gen manusia bisa disisipkan ke bakteri? Lewat rekayasa genetika: enzim restriksi memotong DNA di urutan tertentu, DNA ligase menyambung fragmen beda sumber, dan PCR memperbanyak fragmen DNA tertentu miliaran kali. Tiga alat ini menjadi tulang punggung bioteknologi modern. Coba pilah di bawah.
Tiga alat dasar
Rekayasa genetika memanipulasi DNA untuk tujuan tertentu — menyisipkan gen, memperbanyak fragmen, atau mengubah ekspresinya. Tiga alat dasarnya: enzim restriksi yang memotong DNA pada urutan tertentu; DNA ligase yang menyambung fragmen DNA dari sumber berbeda; PCR (polymerase chain reaction) yang memperbanyak fragmen DNA tertentu secara eksponensial. Ketiganya, sering dengan plasmid sebagai vektor pembawa gen, memungkinkan produksi insulin bakteri, tanaman tahan hama, dan tes DNA forensic.
Enzim restriksi (endonuklease) adalah enzim yang memotong DNA pada urutan basa tertentu (sering palindromik). DNA ligase adalah enzim yang menyambung fragmen DNA dengan ikatan fosfodiester. PCR (polymerase chain reaction) adalah teknik memperbanyak fragmen DNA tertentu secara eksponensial lewat siklus denaturasi-annealing-ekstensi.
Pasangkan enzim dengan fungsinya.
Enzim restriksi dan DNA ligase
Enzim restriksi (endonuklease restriksi) berasal dari bakteri sebagai sistem pertahanan terhadap virus. Tiap enzim mengenali urutan basa tertentu, biasanya palindromik (dibaca sama dua arah), dan memotong di sana. Contoh: EcoRI mengenali GAATTC dan memotong antara G dan A, menghasilkan ujung lengket (sticky end). Ujung lengkung ini dapat berpasangan dengan fragmen lain yang dipotong enzim sama. DNA ligase lalu menyambung kedua fragmen dengan ikatan fosfodiester. Inilah dasar pembuatan DNA rekombinan: gen manusia disisipkan ke plasmid bakteri.
Sorot ciri PCR.
PCR: memperbanyak DNA
PCR (polymerase chain reaction) dikembangkan Kary Mullis (1983, Nobel 1993). Dengan PCR, satu fragmen DNA dapat diperbanyak miliaran kali dalam beberapa jam. PCR memerlukan: cetakan DNA, primer (potongan DNA pendek penanda awal), DNA polimerase tahan panas (Taq polimerasi dari Thermus aquaticus), dan nukleotida. Siklusnya: (1) denaturasi 95 °C (DNA berpisah jadi untai tunggal), (2) annealing 55-65 °C (primer menempel), (3) ekstensi 72 °C (Taq polimerase memperbanyak). Tiap siklus jumlah DNA berlipat dua — 30 siklus menghasilkan ~1 miliar kopi.
Susun langkah PCR.
Bayangkan rekayasa genetika seperti memotong-menempel artikel majalah. Enzim restriksi adalah gunting khusus yang memotong hanya pada kata tertentu — misalnya, selalu memotong di kata “GAATTC”. Karena gunting itu memotong di kata yang sama, dua artikel yang berbeda dapat disambung di tempat potongan itu (ujung lengket). DNA ligase adalah lem yang merekatkan sambungan. PCR adalah mesin fotokopi yang menggandakan satu halaman menjadi miliaran dalam beberapa jam.
Coba dulu di kertas, baru buka.
Soal. Bagaimana gen insulin manusia dapat disisipkan ke plasmid bakteri?
Gen insulin dan plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sama → menghasilkan ujung lengkung komplementer.
Gen insulin dan plasmid disambung dengan DNA ligase → plasmid rekombinan membawa gen insulin.
Jebakan: menyamakan enzim restriksi dengan enzim pencerna protease. Yang benar: enzim restriksi adalah endonuklease — memotong DNA (asam nukleat) di urutan tertentu. Protease memotong protein. Keduanya enzim “pemotong” tetapi substrat berbeda jauh. Enzim restriksi berasal dari bakteri sebagai “sistem imun” melawan virus DNA.
Jebakan: mengira PCR memperbanyak seluruh genom. Yang benar: PCR hanya memperbanyak fragmen DNA yang berada di antara dua primer. Primer menentukan awal dan akhir fragmen yang akan diamplifikasi. Inilah keunggulan PCR — selektif memperbanyak hanya bagian yang diinginkan, bukan seluruh genom. Bila butuh seluruh genom, digunakan teknik lain (kloning seluler).
- Enzim restriksi: memotong DNA di urusan tertentu (ujung lengket).
- DNA ligase: menyambung fragmen DNA beda sumber.
- Plasmid: vektor pembawa gen ke sel inang.
- PCR: amplifikasi fragmen DNA secara eksponensial.
- PCR butuh primer, Taq polimerase, nukleotida, siklus panas.